Myśl o zorganizowaniu Muzeum Regionalnego w Pilźnie zrodziła się w 2004 r. podczas obchodów 650 rocznicy istnienia Pilzna. Z taką inicjatywą wystąpili wspólnie: władze miasta w osobie ówczesnego burmistrza Józefa Chmury, członkowie Towarzystwa Przyjaciół Pilzna i Ziemi Pilźnieńskiej na czele z prezesem Jackiem Podlaskiem, a także dyrektor Domu Kultury, pan Andrzej Kozik. Realizacja przedsięwzięcia wymagała jednakże kilku lat przygotowań.
W 2010 r Rada Miejska w Pilźnie podjęła uchwałę o wynajmie i przeznaczeniu budynku dawnej organistówki na działalność kulturalną. Budynek ten został wzniesiony w 1908 r., a usytuowany tuż za świątynią parafii pw. św. Jana Chrzciciela w Pilźnie. Dwa lata później rozpoczął się remont gmachu i jego adaptacja na potrzeby nowej placówki muzealnej. W 2013 r., pod kierownictwem Lidii Luchter - Krupińskiej, rozpoczęto prace nad gromadzeniem eksponatów, określeniem profilu muzeum oraz tworzeniem ekspozycji stałych. Organizacji muzeum towarzyszyły liczne działania promocyjne zachęcające lokalną społeczność do przekazywania placówce pamiątek oraz dóbr kultury, dotyczących historii miasta i regionu. W dniach 10 i 11 listopada 2013 r. zorganizowano wystawę wstępną, na której zaprezentowano już pozyskane eksponaty, a także perspektywy rozwoju zbiorów muzealnych. 27 marca 2014 r. Rada Miejska w Pilźnie, na wniosek Burmistrz Pilzna Pani Ewy Gołębiowskiej, podjęła uchwałę o powołaniu muzeum jako instytucji działającej w strukturach samorządowej instytucji kultury - Domu Kultury w Pilźnie.
Uroczyste otwarcie Muzeum Regionalnego w Pilźnie miało miejsce 4 października 2014 r., podczas obchodów 660-lecia lokacji miasta.